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本制品是2×实时定量PCR扩增的预溶液，具有荧光强度高，灵敏度高和特异性强，扩增产量高等特点，颜色为蓝色，具有加样示踪的作用。核心组分Hiper Spec Taq DNA聚合酶采用抗体法热启动，可以有效抑制样品准备过程中引物退火导致的非特异性扩增。同时配方添加了提升PCR反应扩增效率因子和均衡不同GC含量(30～70%)基因扩增的促进因子，使定量PCR可以在宽广的定量区域内获得良好的线性关系。

• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
  
• 解冻后2×Mix可能出现絮状或白色沉淀，手握缓慢溶解并上下轻柔颠倒混匀至溶液澄清，不影响试剂性能。
  
• 推荐使用第一链cDNA合成预混液(去除gDNA)，以有效去除RNA样品中残留的基因组。
  
• 若需要电泳，为了获得清晰的条带，建议将qPCR产物稀释20～30倍后进行电泳。
  
• 本制品仅作科研用途。

• 推荐qPCR反应体系：
  

  成分	20μL反应体系	50μL反应体系	终浓度
  2×Hiper Spec Advanced SYBR qPCR Mix	10μL	25μL	1×
  正向引物(10μM)	0.4μL	1μL	0.2μM
  反向引物(10μM)	0.4μL	1μL	0.2μM
  模板DNA/cDNA	X	Y	－
  无菌超纯水	至20μL	至50μL	－

  • 通常引物终浓度为0.2μM，也可以根据情况在0.1～1.0μM之间进行调整。
    
  • 如模板为未稀释cDNA原液，使用体积不应超过qPCR反应总体积的1/10，最佳模板加入量以保证扩增得到的Ct值在20～30个循环为宜。
    
  • 推荐使用20μL或50μL，以保证目的基因扩增的有效性和重复性；上机前需充分混匀，避免剧烈震荡产生过多气泡。
• 设置qPCR反应程序：
  

  步骤	温度	时间	循环数
  预变性	95℃	2min	1
  变性	95℃	10sec	40
  退火/延伸	60℃	30sec

  • 退火温度和时间：请根据引物和目的基因的长度进行调整。
    
  • 荧光信号采集：请勿忘记打开荧光信号采集，按照仪器使用说明书要求进行实验程序设置，几种常见仪器的时间设定如下：
    20sec：Applied Biosystems 7700,7900HT,7500 Fast
    31sec：Applied Biosystems 7300
    32sec：Applied Biosystems 7500
    
  • 熔解曲线：通常情况下可以使用仪器默认程序。

• ABI:7500,7500 Fast,ViiA7,QuantStudio1,3 and 5,QuantStudio 6,7,12k Flex;
  
• Stratagene:MX3000P,MX3005P,MX4000P;
  
• Bio-Rad:CFX96,CFX384,iCycler iQ,iQ5,MyiQ,MiniOpticon,Opticon,Opticon 2,Chromo4;
  
• Eppendorf:Mastercycler ep realplex,realplex 2 s;
  
• Qiagen: Corbett Rotor-Gene Q,Rotor-Gene 3000,Rotor-Gene 6000;
  
• Roche Applied Science:LightCycler 480,LightCycler 2.0,Lightcycler 96;
  
• Thermo Scientific:PikoReal Cycler;Cepheid:SmartCycler;Illumina:Eco qPCR.

• 推荐引物长度25bp左右。扩增产物长度150bp为佳，可以在100bp～300bp内选择。
  
• 正向引物和反向引物的Tm值相差不宜超过2℃。引物Tm值60℃～65℃为佳。
  
• 引物碱基分布均匀，避免出现连续的4个相同碱基，GC含量控制在50%左右。3’端最后一个碱基最好为G或C。
  
• 引物内部或者正反两条引物间最好避免出现有3个碱基以上的互补序列。
  
• 引物特异性需要用NCBI BLAST程序进行核对。避免引物3’端有2个碱基以上的非特异性互补。
  
• 设计完成的引物需要进行扩增效率的检测，只有具备相同扩增效率的引物才可用于定量比较分析。